脊椎動物の老化を研究するのに適したモデル生物である Nothobranchius furzeri の高速逆遺伝学システム

Scientific Reports volume 12、記事番号: 11628 (2022) この記事を引用

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アフリカ産ターコイズメダカ Nothobranchius furzeri (N. furzeri) は、老化、加齢に関連した病気、胎児の休眠を研究するための有用なモデル生物です。 N. furzeri における CRISPR/Cas9 媒介遺伝子ノックアウトおよび Tol2 トランスポゾン媒介遺伝子導入は以前に報告されています。 しかし、これらの方法ではノックアウト魚やトランスジェニック魚を作製するのに時間がかかります。 また、大きなDNA断片を蛍光レポーター構築物としてN. furzeriの標的遺伝子に挿入するノックイン技術はまだ確立されていない。 今回我々は、三重標的CRISPRを介した単一遺伝子破壊により全身二対立遺伝子ノックアウトが効率的に生じ、F0世代における遺伝子機能の検査が可能になることを示す。 さらに、CRISPR/Cas9システムを最適化することにより、交雑せずにノックインレポーターN. furzeriを作成する方法を開発しました。 これらの方法は実験時間を大幅に短縮し、これらの進歩によりN. furzeriを用いた老化と発生の研究が加速すると考えられます。

アフリカターコイズメダカ (N. furzeri) は、新興モデル脊椎動物です 1,2。 ゼブラフィッシュやメダカなどの他の小型実験魚と同様に、実験室で低コストで維持できます。 N. furzeri のいくつかの近交系も確立されています。 これらの中で、GRZ 株は、ジンバブエのゴナ・レ・ジョウ国立公園で収集されたサンプルに由来する最も頻繁に使用される系統です3。 GRZ 幼虫は急速に成長し、4 ～ 5 週間で性的に成熟しますが、最長寿命はわずか 3 ～ 4 か月です。 これは脊椎動物種の中で最も短い寿命であり、老化や加齢に伴う疾患の研究に有益です4。 さらに、N. furzeri の胚の発生過程もゼブラフィッシュやメダカの胚の発生過程とは大きく異なり、3 つのユニークな特徴があります。 1 つ目は初期卵割中の遅い細胞周期、2 つ目は原腸形成開始前の細胞の分散と再凝集、3 つ目は通性的発達停止状態である休眠に入る能力です。 休眠により、生物は極限環境で長期間生存することができます5,6。

遺伝子の機能を調べるには、遺伝子発現パターンの視覚化を可能にするノックアウト動物やレポータートランスジェニック動物が強力なツールとなります。 N. furzeri における CRISPR/Cas9 媒介遺伝子ノックアウトおよび Tol2 トランスポゾン媒介レポーター遺伝子導入の方法は、以前に報告されています 7,8。 しかし、これらの方法では、ノックアウト魚やトランスジェニック魚を生産するには長い時間と広い飼育場が必要です。 たとえば、CRISPR/Cas9 システムによって N. furzeri の全身二対立遺伝子ノックアウトを生成するには、少なくとも 2 ラウンドの交配が必要で、さらに 6 か月かかりました。これは、第一世代のトランスジェニック魚の体が野生型で構成されているためです。ヘテロ接合性で、少数の両対立遺伝子変異細胞が含まれます。 変異細胞が生殖系列に寄与している場合、次世代の子孫にはヘテロノックアウト魚が含まれ、さらに交雑するとメンデル率でホモノックアウト魚が生まれる可能性があります。 Tol2 システムを介した蛍光レポーター魚の生産にも少なくとも 1 回の交雑が必要であり、レポーターがレポーターを含む F0 世代の内因性遺伝子発現パターンを反映できるかどうかを判断するのは困難です。 Tol2 システムとは別に、遺伝子ノックインもレポーター N. furzeri の生成に役立ちます。 N. furzeri のゲノムに 30 ～ 50 bp の DNA 断片を挿入していくつかのアミノ酸配列を交換する遺伝子ノックイン技術はこれまでに報告されているが9、大きな DNA 断片（約 700 bp）を蛍光レポーター遺伝子として導入する方法はまだ報告されていない。確立されている。

この研究では、単一遺伝子を標的とする 3 つのショートガイド RNA (sgRNA) を導入することで CRISPR/Cas9 法を改良し、F0 世代の N. furzeri でほぼ 100% の成功率で全身二対立遺伝子ノックアウトを実現しました。 さらに、Cas9 mRNAにsgRNAを注入して特定のゲノム領域を消化し、ヒートショックプロモーターと蛍光レポーター遺伝子を含むドナープラスミドを消化することにより、F0世代の内因性遺伝子発現パターンを反映する蛍光レポーターを高効率に生成する方法を作成しました。 これらの手法により実験に必要な時間とスペースが大幅に削減され、N. furzeriを用いた発生・老化研究が加速することが期待されます。